近日，中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室尹文兵研究团队通过解析α, b'-二硫桥形成后的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，揭示了多硫代二酮哌嗪类化合物（ETP）次级代谢产物隐秘结构多样性的形成机制（Angewandte Chemie, 2023, 135, e202217212）。该研究团队于2023年5月9日，在化学领域权威期刊Angewandte Chemie再次发表文章，题为“An ortho-quinone methide mediates disulfide migration in the biosynthesis of epidithiodiketopiperazines”，揭示了关键中间体邻亚甲基苯醌（ortho-quinone methide，o-QM）参与ETP非典型α, b'-二硫桥形成的酶催化机制。

本项研究中，研究团队通过基因敲除和次级代谢产物分离，共鉴定21个新结构，解析了α, b'-二硫桥形成前的pretrichodermamide A生物合成步骤（图1），具有CXXC motif的黄素依赖型氧化酶TdaR负责氧化α, α'-二硫醇，形成α, α'-二硫桥；乙酰基转移酶TdaF催化b'-羟基的乙酰化；细胞色素P450氧化酶TdaP催化C5', C6'-羟基化；具有CXXQ motif的黄素依赖型氧化酶TdaE负责催化非典型α, b'-二硫桥的形成。这些结果表明α, α'-二硫桥、b'-乙酰基和C5', C6'-羟基的形成，是构建α, b'-二硫桥的先决条件，体外蛋白反应证实了TdaE经由关键中间体o-QM，催化α, α'-二硫桥的迁移，进而形成非典型的α, b'-二硫桥。

图1. Pretrichodermamide A中α, b'-二硫桥形成前的生物合成步骤和隐秘结构多样性

通过蛋白定点突变和体外反应，研究团队推测了一个新颖的α, b'-二硫桥酶催化机制，谷氨酰胺残基（Q140）夺取C5'-羟基氢，使得b'-乙酰基基团离去，形成o-QM中间体；紧接着，半胱氨酸残基（C137）进攻α, α'-二硫桥，使其发生迁移，形成α, b'-二硫桥和呋喃环（图2）。生物信息学和系统进化分析结果表明，真菌硫桥形成相关的黄素依赖型氧化酶分为四类，具有高度保守CXXC motif的氧化酶负责催化硫醇氧化，形成二硫桥；具有CXXQ和CXXH motif的氧化酶负责催化α, α'-二硫桥的迁移，形成非典型的α, b'-二硫桥。本项研究通过解析α, b'-二硫桥形成前的pretrichodermamide A复杂生物合成步骤，揭示了ETP中非典型α, b'-二硫桥的普适性形成机制，为ETP活性分子的酶法创制提供了理论基础。

图2. ETP中非典型α, b'-二硫桥的形成机制

本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委、中国科学院从0到1原始创新项目、中国科学院战略生物资源服务网络计划生物资源衍生库项目和博士后科学基金的资助。尹文兵研究员为本文通讯作者，特别研究助理范洁博士和冉火苗博士为共同第一作者，德国马尔堡大学李书明教授对本研究给予了大力支持。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202304252