近日，中南林业科技大学、岳麓山实验室刘高强课题组在分析化学领域权威期刊Analytical Chemistry（中科院一区Top，IF：8.008）发表了题为“Non-Destructive and Quantitative Analysis of Cell Wall Regeneration in Medicinal Macrofungus Ganoderma lingzhi by Membrane-fusing Fluorescent Probe”的研究论文，采用膜融合荧光探针技术，实现了对重要真菌灵芝原生质体再生过程的实时无损伤定量监测。成果以“封面论文”的方式发表在Analytical Chemistry 2023年第95卷第21期。《Analytical Chemistry》是分析化学领域享有高度学术声誉的老牌期刊，入选自然指数（Nature Index）全球首批68个期刊之一。论文第一作者为石沐玲博士，通讯作者为刘高强教授；中南林业科技大学为第一单位和通讯作者单位，湖南大学、海南大学为合作单位。
灵芝是一种珍贵的大型药用真菌，具有广泛的药用价值。原生质体是细胞融合和遗传工程的理想受体，因此，原生质体是研究灵芝细胞的生理、代谢、遗传等相关科学问题的重要工具。原生质体及其再生细胞壁的评估通常依赖于电子显微镜分析，但电子显微镜方法不适用于原生质体再生过程的动态监测，因为其样品必须经过固定和脱水过程，同时，单个显微图像提供的信息较为碎片化和离散化，很难量化给出样本中形态特征的参数；如果要实现样品的全面研究，需要对每个视图逐一进行单独分析，这需要付出大量努力和时间。相比之下，基于荧光的分析方法，能够对活细胞进行实时检测和成像；同时荧光标记也可以应用于流式细胞术，利用流式细胞术快速、高能量信息采集和分析的特点，提供样本整体情况的量化信息。
然而，与细菌等典型微生物相比，大型真菌如灵芝，由于其自身荧光蛋白同源表达的阻碍和缺乏合适的荧光抗体标记，原生质体和再生细胞壁的荧光分析比较困难。针对上述问题，本研究开发了一种能锚定和标记灵芝质膜的特异性质膜探针——TAMRA（羧基四甲基罗丹明）全氟化碳核酸探针（TAMRA perfluorocarbon nucleic acid probe, TPFN），用于灵芝细胞壁再生的无损定量荧光分析。
TPFN探针的组成及工作原理如下图1所示，探针引入仅由碳和氟组成的安全无毒的烃类化合物全氟化碳链作为疏水部分，此部分通过疏水作用能与原生质体质膜锚定，激发出较强的荧光，然后引入核酸作为亲水部分，连接全氟化碳链和TAMRA荧光分子。TPFN锚定灵芝原生质体质膜后，产生强烈的荧光信号，当细胞壁再生发生时，由于全氟化碳对灵芝细胞膜的选择性，荧光强度降低，根据荧光信号的变化可以量化灵芝原生质体细胞壁的再生程度，即可以通过荧光信号的强度来指示细胞壁再生的过程。探针的全氟代烷部分具有高疏水性、柔性的双链结构，相比于哺乳动物细胞膜探针常用的脂质分子，其对灵芝细胞膜的锚定具有更好的特异性。探针所采用的寡核苷酸序列使探针具有良好的生物亲和性、水溶性，同时赋予探针一定的体积位阻。探针信号由具有绿色激发的TAMRA发出，使探针信号不受真菌自发荧光的影响。经试验证明探针插膜效率和细胞壁重生的程度成比例关系，进而实现了通过流式和荧光成像手段区分细胞壁的有无，并且可以通过流式统计方法对细胞壁再生过程进行定量分析。
图1 TPFN的工作原理和化学结构示意图
其它主要试验结果见图2-图6。
图2 灵芝菌丝生长菌落（A）、显微形态（B），以及原生质体（C）及其流式细胞仪检测（D）
图3 TPFN与灵芝原生质体的相互作用。多通道流式细胞仪检测结果（A）和共聚焦荧光显微结果（B）：TPFN与灵芝原生质体结合后，产生强烈的荧光信号。
图4 探究TPFN对灵芝细胞膜的锚定功能
图5 TPFN锚定灵芝原生质体膜的特异性分析
（A）灵芝原生质体；（B）生长36h细胞壁再生后的原生质体；（C）TPFN与原生质体及细胞壁再生原生质体孵育后的流式直方图；（D）荧光共聚焦显微镜观察TPFN与最初原生质体（上图）和细胞壁再生原生质体（下图）的结合特异性
图6 灵芝原生质体再生过程的定量监测。流式直方图内的染色细胞比例数值随着细胞壁再生逐步下降。
本论文通过分析化学手段较好地解决了生物学研究中大型真菌原生质体及其再生的动态监测问题。本工作对功能核酸荧光探针在真菌、特别是多细胞的大型真菌上的应用进行的探索，预期能够启发相关研究者们为分子生物学研究常用的真菌细胞转化等操作提供新的监测手段。此外，开发的荧光核酸探针平台也具有较好的可拓展性，对其稍作修改或整合后，可适用于其他细胞原生质体的制备、环境应力下细胞壁完整性的检测，以及用于微生物细胞生物学和生理学研究的可编程膜工程等领域。
原文链接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.3c01016